Vairāk nekā četru miljonu vienību lielā LNB krājuma kodols ir nacionālais krājums — Latvijas un ārzemju izdevumi par Latviju un latviešiem, latviešu autoru darbi, kuru krāšana, saglabāšana un pieejamības nodrošināšana ir LNB pamatuzdevums un krājuma veidošanas prioritāte. Nacionālās literatūras krājuma pilnīgumu nodrošina 1920. gadā iedibinātais Latvijas obligātais eksemplārs.

Bibliotēka izveidojusi vienu no diviem lielākajiem nacionālajiem krājumiem un kļuvusi par nozīmīgāko universālo zinātnisko bibliotēku valstī. LNB krājuma tematiskais profils ir humanitārās un sociālās zinātnes. Izdevumi svešvalodās tiek komplektēti visās zinātņu nozarēs, bet ar atšķirīgu intensitāti, ņemot vērā arī citu Latvijas lielo zinātnisko bibliotēku krājumu specializāciju.

Bibliotēkas krājuma daudzveidību un bagātību atspoguļo tās speciālie krājumi: Letonika, Baltijas Centrālā bibliotēka, retās grāmatas un rokraksti, bērnu literatūra, periodiskie izdevumi, notis un mūzikas literatūra, skaņu ieraksti, kartogrāfiskie izdevumi, sīkiespieddarbi un attēlizdevumi.

Sociālo zinātņu, Humanitāro zinātņu, Juridiskās literatūras un likumdošanas lasītavās, Uzziņu un informācijas centrā atrodama jaunākā, aktuālākā un pieprasītākā speciālā nozaru literatūra. Šo lasītavu krājumi ik gadu tiek atjaunoti un papildināti ar vairāk nekā trim tūkstošiem jaunu Latvijas un ārzemju izdevumu. Bibliotēkzinātnes un informācijas zinātnes lasītava nodrošina speciālistus ar laikmetīgu profesionālo informāciju.

Aizvien plašāks kļūst kā Latvijas, tā ārzemju licencēto elektronisko datubāzu piedāvājums. LNB kopumā abonē vairāk nekā 40 dažādas pilnu tekstu un bibliogrāfiskās datubāzes, ir izveidota specializēta Elektronisko resursu lasītava.

Lai padarītu plašāk pieejamas LNB glabātās kultūrvēsturiskās vērtības, tiek veidota Latvijas Nacionālā digitālā bibliotēka.

Līdzās obligātajam eksemplāram un iepirkumiem, nozīmīgs komplektēšanas avots ir starptautiskā iespieddarbu apmaiņa. LNB sadarbības partneri ir gandrīz visu Eiropas valstu nacionālās bibliotēkas, ASV, Kanāda, Japāna, Krievija, Baltkrievija, Ukraina un citas valstis, kopā 61 sadarbības partneris 21 valstī.

Būtisks krājuma papildināšanas avots ir dāvinājumi. 20. gs. 90. gadu sākumā, atjaunojoties valsts neatkarībai, tautieši no visām mītnes zemēm sūtīja un turpina sūtīt bibliotēkai trimdā izdotās grāmatas. Pateicoties tam, arī šī nacionālā krājuma daļa ir pārstāvēta gandrīz pilnīgi.

Nozīmīgus dāvinājumus LNB ir saņēmusi no Vācijas augstskolu rektoru konferences (1991), Zviedrijas Karaliskās bibliotēkas (1993), ārvalstu vēstniecībām,UNESCO Latvijas Nacionālās komisijas, LR Ārlietu ministrijas un citām organizācijām, kā arī privātpersonām. 2008. gadā LNB krājuma veidošanu atbalstīja Hansabanka.

Krājuma veidošanu kopš 1997. gada koordinē Krājuma attīstības padome — profesionāla darba grupa, kuru veido visu nozaru bibliotekāri.

Lielākais izaicinājums un krājuma attīstības uzdevums tuvākajiem gadiem — 350 tūkstošus sējumu liela brīvpieejas krājuma izveidošana LNB jaunajai ēkai, esošā krājuma izvērtēšana un kvalitatīva atjaunošana, elektronisko resursu krājuma attīstība.